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La embriogénesis somática consiste en la producción de embriones a partir de células puramente somáticas cultivadas in vitro y en total ausencia del proceso de fecundación. La aplicación más inmediata de la embriogénesis somática en las plantas es debida a su enorme capacidad de regeneración de plantas, de lo cual se deriva su potencial para la propagación in vitro.
Además, constituye una excelente herramienta para el estudio del proceso de formación de los embriones y para el desarrollo de aplicaciones enfocadas a la mejora genética de las plantas.
En la vid, la embriogénesis somática es conocida desde la década de los años 50, y se obtiene normalmente a partir de tejidos somáticos de órganos florales, como las anteras o los ovarios. En los últimos años en el laboratorio del Profesor Manuel Rey, de la Universidad de Vigo, se han desarrollado sistemas de embriogénesis somática en seis cultivares autóctonos de Galicia, tres blancos (Albariño, Treixadura y Torrontés) y tres tintos (Mencía, Brancellao y Merenzao), utilizando inflorescencias recogidas en campo en estado de racimos separados.
En este estado, la competencia de los tejidos para producir embriogénesis somática está relacionada con el desarrollo de las microsporas, que deben estar entre los estados uninucleado y binucleado. Este estado de desarrollo se determina en el laboratorio antes de iniciar los cultivos utilizando una tinción fluorescente. A continuación, los órganos que contienen los tejidos competentes (estambres y ovarios) se extraen en condiciones asépticas y se cultivan en un medio de inducción de embriogénesis somática.
Este medio, entre otros componentes (sales minerales y vitaminas principalmente), contiene fitohormonas, concretamente una auxina (ácido diclorofenoxiacético ó 2,4-D) que es la responsable específica de la inducción de la embriogénesis somática, y una citoquinina que favorece la división de las células y por tanto la respuesta. Dependiendo de la citoquinina utilizada se pueden obtener dos rutas de embriogénesis somática alternativas.
El primer protocolo desarrollado utiliza bencil-adenina (BA) como citoquinina, lo cual produce que la respuesta tenga lugar a partir de los tejidos somáticos de las paredes de las anteras y de los ovarios, produciéndose un callo embriogénico al cabo de un mínimo de 6 meses de cultivo. Un callo embriogénico es una masa de células sin organización definida, que contiene las células que van a dar lugar a los embriones somáticos.
Mas recientemente se estableció un protocolo alternativo, que es el que se utiliza rutinariamente en la actualidad, empleando TDZ (tidiazurón, una molécula sintética) como citoquinina, siendo el resto de componentes del medio de inducción exactamente los mismos. En estas condiciones, el modelo de inducción cambia radicalmente, obteniéndose embriogénesis somática de forma directa, es decir, sin la formación de callo, solamente a partir de los filamentos de los estambres, y en tan solo 3 meses de cultivo.
¿Como generar una planta de vid a partir de un embrión?
Los cultivos de embriones se mantienen in vitro en el mismo medio de inducción. Para la regeneración final de una planta normal a partir de cada uno de ellos se siguen una serie de pasos perfectamente definidos. En primer lugar, los embriones deben completar su desarrollo y madurar correctamente, incluyendo su entrada en dormición para después germinar normalmente, al igual que los embriones cigóticos presentes en las semillas.
Ello se consigue cultivándolos sobre una membrana semipermeable en un medio de diferenciación sin fitohormonas. Con ello se consigue una desecación parcial que provoca el aumento del contenido endógeno de la fitohormona ácido abscísico y la ralentización del crecimiento de los embriones.
Una vez completado su desarrollo, los embriones maduros se individualizan y transfieren a medio de germinación. Finalmente, los embriones germinados se transfieren a otro medio denominado de conversión a planta, donde tiene lugar la formación de una planta normal a partir del embrión germinado.
Mediante la embriogénesis somática permite mejorar la investigación en viticultura
El principal interés científico para nuestro grupo es el estudio fisiológico y molecular del proceso de embriogénesis somática. No obstante, el desarrollo de métodos de trabajo aplicables al estudio de este proceso en particular, da lugar a aplicaciones mas directamente relacionadas con la viticultura, como son la identificación y el análisis de la variabilidad natural presente en el viñedo, o el análisis genómico de caracteres de interés para la viticultura en distintos aspectos.
Por tanto, la utilización de herramientas biotecnológicas como la embriogénesis somática ofrece oportunidades de investigación en viticultura, en particular debido a la disponibilidad de dos borradores de la secuencia del genoma de la vid, ambas basadas en el cultivar francés Pinot Noir. El genoma de la vid es de tamaño medio, conteniendo aproximadamente 485 millones de pares de bases nucleotídicas agrupadas en 19 pares de cromosomas.
Como parte fundamental del desarrollo de la embriogénesis somática, se evalúa la estabilidad genética de los cultivos mediante citometría de flujo, debido a que la forma más frecuente de alteraciones genéticas durante el cultivo in vitro son los cambios cromosómicos. La estabilidad genética de los cultivos embriogénicos en nuestro laboratorio es de alrededor del 95% por regla general. En el 5% restante, las principales alteraciones cromosómicas que se observaron fueron sobre todo la presencia de plantas tetraploides. Una planta de vid es tetraploide porque cada célula contiene 4 pares de cromosomas, que es el doble que en las plantas normales diploides. Además, se observó alguna planta octoploide (8 pares de cromosomas) y mixoploide (plantas que contienen simultáneamente células normales diploides y células tetraploides). En casi todos los casos, las alteraciones se debieron al proceso de cultivo in vitro, puesto de manifiesto porque las plantas de campo originales utilizadas como controles no presentaron ninguna alteración de este tipo.
Unicamente se observó una proporción anormalmente alta de plantas regeneradas de genotipo tetraploide en el cv. Brancellao. El análisis por citometría de flujo de las plantas originales de campo de este cultivar indicó que la mitad de sus muestras contenían genotipos mixoploides, con un pico correspondiente a los núcleos diploides y simultáneamente otro correspondiente a los núcleos tetraploides. La conclusión es que la embriogénesis somática se produjo a partir de células con dos niveles de ploidía, dando lugar a plantas enteramente diploides por un lado y por otro plantas enteramente tetraploides. Ello es posible debido a que los embriones somáticos en la vid son de origen unicelular, hecho que no sucede igualmente en todas las plantas.
Identificación xenética da vide mediante microsatélites
Otro método de identificación genética disponible en nuestro laboratorio es el análisis por microsatélites, los marcadores moleculares más utilizados en la vid. Los microsatélites son pequeñas secuencias (2-6 nucleótidos) de ADN que se repiten consecutivamente entre 5 y 100 veces. Son útiles como marcadores genéticos porque las diferencias entre los distintos cultivares de vid se debe a variaciones en el número de repeticiones de la secuencia característica de cada microsatélite.
El genotipo de un microsatélite se determina realizando una reacción específica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y analizando el producto de la reacción mediante un secuenciador automático de ADN. Los resultados se proporcionan anotando numéricamente la longitud de la secuencia de ADN de cada microsatélite. Como la vid es diploide, contiene dos copias de la secuencia de cada microsatélite, que pueden ser idénticas (planta homocigota para ese microsatélite) o distintas (heterocigota).
Mediante este análisis hemos elaborado una base de datos de microsatélites basada en los genotipos de 9 microsatélites para 7 cultivares de vid. Esta base de datos se puede aplicar al análisis de estabilidad de los embriones somáticos generados en nuestro laboratorio. Así, hemos observado que todas las plantas regeneradas mediante embriogénesis somática eran conformes al genotipo normal de microsatélites en todos los cultivares estudiados. Unicamente encontramos algunas plantas del cultivar Torrontés que presentaron una mutación consistente en una deleción (eliminación) de 6 nucleótidos en un microsatélite, hecho bastante infrecuente ya que como se ha comentado anteriormente, la forma más frecuente de alteraciones genéticas es el cambio en el número de cromosomas.
La embriogénesis somática también es útil para generar mutaciones que sirvan para el análisis genómico en la vid. Es decir, se pueden generar embriones somáticos con mutaciones puntuales en genes determinados que nos permitan obtener información sobre su función. Esto también es posible debido al origen unicelular de los embriones somáticos, así como en la reducida tasa de alteraciones genéticas que produce nuestro protocolo de embriogénesis somática.
Estas mutaciones se pueden generar en nuestro laboratorio utilizando un agente mutágeno, el etilmetano sulfonato (EMS), que provoca mutaciones puntuales en el ADN, y que son identificables mediante métodos moleculares. Esto permite el análisis de los determinantes genéticos que controlan la biología de la especie en todos sus aspectos, incluyendo los derivados de la práctica vitivinícola, resistencia a enfermedades o caracteres de calidad.
